實驗推薦——分子標記技術AFLP

實驗方法原理：

AFLP 是RFLP與PCR兩種技術的優點相結合的產物，它既克服了 RFLP 技術復雜、有放射性危害 和 RAPD 穩定性差，標記呈現隱性遺傳的缺點；同時具有分辨率高、穩定性好、效率高的優點。但它的技術費用昂貴，對 DNA 的純度和內切酶的質量要求很高。

其基本原理是先利用限制性內切酶水解基因組 DNA 產生不同大小的 DNA 片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相連接，作為擴增反應的模板 DNA，然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，最后在接頭互補鏈的基礎上添加 1—3個選擇性核苷酸作引物對模板 DNA 基因再進行選擇性擴增，，然后把擴增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進行電泳，多態性即以擴增片段的長度不同被檢測出來。

本 AFLP 技術主要特點 ：分析所需DNA 量少，僅需 0.5g；可重復性好；多態性強；分辨率高；不需要 Southern 雜交；樣品適用性廣；

AFLP 技術被認為是一種十分理想、有效的分子標記。

實驗材料：

1.1           樣品保存與運輸

實驗步驟：

1.2           DNA 提取（實驗方法視DNA來源而異，此處以普通植物樣本為例）

CTAB法提取

1） 稱取材料50mg，液氮研磨三至四次

2） 將粉末放到裝有800µl 2×CTAB提取緩沖液的2ml離心管中

3） 加入60µl巰基乙醇混勻，60度預熱30min

4） 其間混勻二至三次取出樣品于室溫放置

5） 待樣品冷卻到室溫加入800µl氯仿：異戊醇（24：1）

6） 振蕩混勻，12000rpm離心15min

7） 取上清到一新2ml離心管，加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1），振蕩混勻，12000rpm離心15min

8） 取上清到一新2ml離心管中加入1.5倍體積1×CTAB沉淀液，放置20-30min，12000rpm離心15min

9） 將沉淀晾干溶于200µl TE-buffer（溶解）

10）      加入400 µl 95% 乙醇，20µl  3M NaAC, -20 ℃ 沉淀1小時

11）      4℃ 離心，12000rpm離心15min

12）      500µl 75%乙醇洗滌，12000rpm離心10min

13）      加入30-50µl TE-buffer

14）      0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測

備注：CTAB法主要針對植物基因組DNA的提取，其它樣品：如動物組織、細胞、菌體等公司有相關試劑盒。

1.3           限制性酶切及連接反應

反應體系

混勻離心數秒 37℃保溫5h ，8℃保溫4h，4℃過夜。

-20℃保存，作為預擴增模板

1.4  預擴增

反應體系

離心數秒,按下列參數進行PCR擴增

94℃  2min

       94℃  30S

       56℃  30S，      30 cycles

      72℃  80S

    72℃  5min

    4 ℃

1.5 選擇性擴增

預擴產物1:20稀釋后作為選擴模板

按以下體系混勻后，離心數秒

按下列參數設置PCR循環

1）   第一輪擴增參數：94℃  30S，  65℃  30S，  72℃  80S

2）   以后每輪循環溫度遞減0.7℃，擴增12輪。

3）   接著按下列參數擴增23輪

94℃  30S，

55℃  30S         23 Cycles

72℃  80S

4)  72℃   5min

 5） 4 ℃

1.6實驗結果

ABI377測序儀電泳檢測。數據通過GENESCAN軟件進分析。

電泳圖譜

峰圖

原始數據

01數據

遺傳聚類圖

實驗說明：

1.7 數據分析說明

1） ROX500分子量內標

      ROX500為ROX紅色熒光標記的分子量內標，從小到大，片段大小依次為：70、80、90、100、120、140、160、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、425、450、475、490、500（bp），共25條帶。

2） 原始數據

  公司為客戶提供ABI377測序儀電泳檢測后的片段大小，即原始數據。數據是通過GENESCAN軟件進分析，軟件每2個堿基讀一次數，Marker片段范圍為 70-500bp，這樣在70-500 bp之間一共讀取216個數，由于不可避免的誤差，在所設置的片段Bin Range范圍內的片段，認為是同一條帶，例如：在71.5-73.5 之間，c1 、c2擴增條帶大小分別為73.00835 和71.9044，這樣的誤差范圍在我們的誤差允許范圍認為是同一條帶。

2）01數據

      在原始數據的基礎上，有帶的地方替換為1，無帶的地方替換為0，這樣構成了01數據，同時給客戶發一份所有01數據匯總后的總數據。

由于軟件要求，我們一般都會給客戶把數據處理成NTSYSpc2.1 這個軟件要求的標準的01數據格式即01總數據。01總數據中 r1-r216 表示第一個引物，r217-r432 代表第二個引物和01分數據一一對應。

如： 一共有8個引物：a-1、a-2、a-3、b-1、b-2、c-1、d-1…….等，在總數據中按順序排列：

   R1-  r216 的數據為：a-1 這個引物的數據

   R217-r432 的數據位：a-2 這個引物的數據……..，以此類推。

常見問題：

 1）客戶委托公司做實驗服務，客戶需要做哪些工作？

    客戶只需提供實驗材料，我們負責DNA提取及后續全部試驗。收到樣品后，我們一般會給客戶做預實驗，根據客戶預實驗結果，客戶滿意度，決定是否安排后續實驗。公司現有64個引物組合，全部為FAM熒光標記，我們會從中篩選條帶清晰、多態性較好的引物組合給客戶。在開始正式實驗前，客戶需支付課題服務一半的費用，余款在公司給客戶發送最后一批數據前，一次結清。

2) 關于AFLP收費價格

目前我們的基本價格是30個樣，6~8對引物，6000元，實驗周期大約為20天，如果您樣品較多或引物組合較多，具體可協商。

3）條帶數太多

PCR產物在ABI測序儀上電泳，檢測系統的靈敏度要比銀染高的多，數據分析是通過GENESCAN軟件進行分析，所以對于很弱的帶，如果人工統計的話，不會把這樣的帶統計進去，但軟件分析的話，會讀到這樣的帶。所以通過測序儀檢測比銀染條帶數多，這個可以理解。另外我們一般通過控制熒光信號強度來控制條帶數，對于擴增強以及擴增相對較弱的引物，通過控制熒光信號強度，盡量保證條帶數在50~60條，最大限度減少由于擴增強度的問題，引起的條帶數的差異，最真實的反映實驗結果。

4）能否找到所有差異帶的具體位置，并回收克隆差異條帶？

請參照提供數據結果中，原始數據部分，數據表中，每個檢測位點都有片段大小，有帶的地方是片段的實際大小，無帶的為0，很容易找到差異帶。目前我們采取的熒光引物，跑測序膠，只能指出差異帶的具體位置及片段大小，不能夠回收克隆差異帶。

5）共有譜帶較少，多態性太高

   共有譜帶為所有樣品在某一位點擴增后共有的條帶。因此只要有一個樣品的擴增不好，或者在這個樣品無擴增，就會導致共有普帶數較少或沒有。所以一定要保證實驗材料新鮮，這樣我們才能夠保證后續試驗中的PCR擴增沒問題。如果樣品確實有問題，為了不影響整體數據要去除這類樣品。

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